Gebelik sadece fetüs veya çocuk sağlığı için kritik bir dönem olmayıp; aynı zamanda maternal doğum sonrası sağlığın da prenatal periyot süresince gelişen değişikliklerden etkilenebileceği yönünde giderek artan kanıtlar söz konusudur. Özellikle gestasyonel hipertansiyon, preeklampsi ve eklampsi gibi gebeliğin hipertansif bozuklukları (GHB) ile tanı konulan kadınlarda sonraki yaşamları boyunca kardiyovasküler hastalık  (KVH) açısından artmış risk mevuttur. Çevresel toksik maddeler GHB riskini – sonuç olarak maternal doğum sonrası kardiyovasküler hastalık riskini- arttırıp arttırmadığı epidemiyolojik literatürde öne çıkan bir sorudur. Current Hypertension Reports dergisinde 2018’de yayınlanmış “Environmental Toxicant Exposure and Hypertensive Disorders of Pregnancy: Recent Findings” başlıklı bu derleme makalesi ¹, yakın tarihli raporların çevresel kimyasallarla GHB ilişkisini özetlemekte ve bu ilişkilerin altında yatan olası biyolojik mekanizmaları tartışıp gelecek araştırmalar için araştırma alanları önermektedir.

Gebeliğin Hipertansif Bozuklukları: Giderek Artan Acil Bir Sorun

GHB önemli bir halk sağlığı sorunudur; maternal, fetal ve neonatal morbidite ve mortaliteye katkıda bulunan öncül durumlar olmakla kalmayıp kadın sağlığına potansiyel uzun dönemli etkileri ile KVH tanısı için riski iki kattan fazla arttırmaktadır. Brown ve arkadaşlarının 43 çalışmayı içeren bir meta- analiz çalışmasında, GHB olmayan kadınlarla karşılaştırıldığında preeklampsi veya eklampsi öyküsü olan kadınların postpartum en az 6 hafta sonrasında, fatal veya tanılı KVH oddsunun 2.28 kat (%95 GA 1.87-2.78), serebrovasküler hastalık için 1.76 kat (%95 GA 1.43-2.21) ve hipertansiyon için 3.13 kat (%95 GA 2.51-3.89) daha fazla olduğu görülmüştür.²

Özellikle preeklampsiye odaklanan 22 çalışmanın meta analizinde, Wu ve arkadaşları preeklampsi öyküsü olan kadınların ileride artmış kalp yetmezliği (risk oranı=4.19 [2.09-8.38]), koroner kalp hastalığı (RO=2.5 [1.43-4.37]), kardiyovasküler hastalık nedeniyle ölüm (RO=2.21 [1.83-2.66]) ve inme (RO=1.81 [1.29-2.55]) riski ile ilişkili olarak bildirmiştir.³ Hemşire Sağlığı Çalışması-II‘de 58.671 katılımcılar arasında gestasyonel hipertansiyon ve preeklampsi, kronik hipertansiyon (sırasıyla Riziko oranı =2.8 [1.83-2.66]),ve 2.2 [2.1-2.3])), tip 2 diyabet (sırasıyla riziko oranı =1.7 [1.4- 1.9] ve 1.8 [1.6-1.9]) ve hiperkolesterolemi (sırasıyla riziko oranı =1.4 [1.3-1.5] ve 1.3 [1.3-1.4]) gibi KVH risk faktörleri açısından artmış risk ile ilişkilendirilmiştir. ⁴

Gebeliğin hipertansif bozuklukları; ABD’de 1993-2014 yılları arasında %73 artmış ve son güncel verilere göre doğumla ilgili yatışlarda 912/10,000’e ulaşmıştır. 2011 ve 2013 yılları arasında GHB gebelik ilişkili ölümlerin %7.4’üne neden olmuştur. GHB insidansı; ileri maternal yaş, nulliparite, multifetal gestasyon, artmış vücut kitle indexi, pregestasyonel diyabet ve kronik hipertansiyon gibi bilinen bir risk faktörlerinin artmasıyla birlikte artmıştır. Sadece yakın zamanda; ağır metaller, kalıcı organik kirleticiler (KOK –persistent organic pollutants-) ve kalıcı olmayan kimyasallar dâhil olmak üzere çevresel toksik maddelerin GHB’e potansiyel katkısı mercek altına alınmıştır.

Çevresel Kimyasallar ve KVH

Çalışmalar, çevresel kimyasal toksik maddelerin gebe dışındaki erişkinlerde KVH için risk faktörü olduğunu göstermiştir. Arsenik, kadmiyum, krom, kurşun ve civa gibi toksik ağır metaller ateroskekleroz, hipertansiyon ve klinik KVH ile ilişkilendirilmiştir. Kaza sonucu, mesleki ve endüstriyel atık ile dioksinler, poliklorlu bifeniller gibi KOK’a maruziyetlerle ilgili çalışmalar da artmış KVH insindasını göstermiştir. Son dekadda ABD toplumunun çoğunluğunda idrar metaboliti olarak saptanabilen kalıcı olmayan kimyasallara karşı artan bir ilgi söz konusudur. İnsan ve hayvan çalışmaları her ne kadar, fitalatlar için sonuçlar daha az tutarlı olsa da bisfenol A (BPA) ve organofosfat (OP) gibi kalıcı olmayan kimyasalların metabolitleri ile KVH ve ilişkili öncül durumların (obezite, tip 2 diyabet gibi) ilişkili olduğunu göstermiştir. KVH ve GHB, yükselmiş kan basıncı, obezite, dislipidemi, insülin direnci, hiperglisemi, inflamasyon, endotel disfonksiyonu, hiperürisemi, hiperkhomosisteinemi, tromboz ve anjiyogenezis dahil olmak üzere fazla sayıda ortak risk faktörü içerdiği için, KVH için riski artıran çevresel kimyasalların aynı biyolojik mekanizmalarla GHB riskini de arttırması mümkündür. Özellikle bu maddelerin çoğunun endokrin bozucu özellikleri, bu maddelere maruziyet ile prenatal periyot süresince hormonal duyarlılık ensasında özellikle yıkıcı etkilerinin olmasına neden olabilir.

Plesental Bağlantı

GHB anormal plesenta gelişimi ve işlevinin sürekliliğin ekstrem bir tezahürüdür. Plasenta bir hem kadından hem de fetüsten doku içeren hibrit organdır. Aralarındaki etkileşim ağını kurar; fetüse oksijen, besinler, immünolojik ve hormonal destek sağlarken, atıkları da kanından uzaklaştırır. Bu değiş-tokuş özelleşmiş bir damar ağı aracılığıyla gerçekleşir. Sağlıklı plasenta gelişimi, optimal fetal büyüme için esastır ve yetersiz vasküler proliferasyon yetersiz perfüzyona neden olabilir; bu da potansiyel olarak intrauterin büyüme kısıtlılığı ve özellikle GHB gibi olumsuz gebelik sonuçları ile sonuçlanabilir. Plasentanın uterun sınırına doğru şekilde implante olmaması ile de plasenta işlev bozukluğu ortaya çıkabilir. Maternal spiral arterlerin maternal-fetal kan akışını optimize eden düşük dirençli damarlara yeniden şekillenmesini uyarmak için fetal trofoblastlar anne miyometriyumunu belirli bir derinliğe kadar invaze etmelidir. Yetersiz invazyon uterin arterlerde artmış dirence ve artmış maternal kan basıncına neden olabilir. Çevresel toksik maddelerin plesental disfonksiyona olası etkisini değerlendirirken, sadece GHB tanısı almış kişilerde değil aynı zamanda pro ve antianjiyojenik faktörlerin maternal serum düzeyleri, maternal kan basıncı ve plesental hemodinamik ölçütleri de içeren GHB’ye doğru giden yolaktaki  subklinik sonuçlarla ilişkilerini de değerlendirmek önemlidir.

“Çevresel Toksik maddeler ile GHB ilişkisi” ile ilgili Güncel Çalışmalar

Son üç yılda çevresel toksikanların GHB ile ilişkisini inceleyen bir grup çalışma yayınlanmıştır. Ağır metal ve KOK üzerinde daha çok durulsa da, kalıcı olmayan kimyasallara olan ilgi de artmaktadır. Aynı zamanda potansiyel biyolojik mekanizmalar özellikle epigenetik belirteçleri öne süren çalışmalarda da farkedilen bir artış söz konusudur.

Ağır Metaller

Ekonomik olarak gelişmiş ülkelerde ağır metal maruziyeti azalmış olsa da dünyadaki bir çok yerde endişe kaynağı olmayı sürdürmektedir. Arsenik, kurşun ve civa; Zehirli Maddeler ve Hastalıkların Kaydı Ajansının 2017 yılına ait Öncelikli Tehlikeli Maddeler Listesinde ilk üç madde olarak verilmiştir. Bu üç madde ve kadmiyumun (bu listede 7.), geniş epidemiyolojik çalışmalarda KVH nedeniyle ölümü arttırdığı gösterilmiştir. Gebelik esnasında maruz kalmanın plasental gelişimi ve işlevini etkilemesi ve kadınlarda GHB’ye predispozan faktör olması olasıdır.

Kurşun 100 yıldan uzun süredir artmış preeklampsi riski ile ilişkilendirilmiştir. Bir sistematik derleme ve meta analizde kan kurşun düzeyinde 1 μg/dL artışın, preeklampsi riskinde %1.6 artış ile ilişkili olduğu ve kurşuna maruz kalmanın preeklampsi için bilinen en güçlü risk faktörlerinden biri olduğunu göstermiştir. İran’da 2015-2016 yılları arasında yapılan, 158 kadının dâhil edildiği vaka kontrol çalışmasında, Bayat ve arkadaşları preeklamptik kadınların normal doğum yapan kadınlara göre üçüncü tirimesterda belirgin şekilde yükskek kan kurşun düzeylerine sahip olduğunu ortaya koymuştur.⁵ Demokratik Kongo Cumhuriyeti’nin başkenti Kinşasa’da trafik kirliliği, atık bertarafı, pil geri dönüşümü ve diğer düzenlenmemiş faaliyetler kaynaklı ağır metallere maruz kalma gibi preeklampsi insidansı da yüksektir. Elongi Moyene ve arkadaşları tarafından yapılan bir vaka kontrol çalışmasında, 24 saatlik idrar örneklerinde kurşun atılımı 82 preeklamptik ve 6 eklamptik kadında 88 toplum kontrol grubunda yer alanlara göre 6.7 kat daha yüksek raporlanmıştır.⁶ Her ne kadar yakın zamanlı maruz kalımın ölçümü için kan kurşun düzeyi tercih edise de 24 saatlik idrar atımı da geçerli bir alternatiftir ve kreatinine göre düzeltme gerektirmez. (Gebelikte görülen glomerüler filtrasyon hızındaki değişiklikler nedeniyle kreatinine göre ayarlama tartışmalıdır.) Buna karşılık, Güney Afrika’da ekonomik olarak daha gelişmiş bir bölge olan Kwa Zulu Natal’da yapılan Maduray ve arkadaşlarının vaka kontrol çalışmasında, 43 preeklamptik ve 23 normotansif kadında doğumda kanda veya pubik kıllardaki ölçülen kurşun düzeyleri arasında bir ilişki bulunamamıştır ancak bu çalışmada da herhangi bir ortak değişken için düzeltme yapılmadığı görülmektedir. Yüksek kurşun düzeyinin preeklampsiyi indüklemesinin temel aldığı varsayımsal mekanizmalar arasında, endotelin, adrenalin, ve noradrenalin gibi vazokonstriktörler ile pozitif ilişkisi ve nitrik oksit ve adenozin trifosfataz gibi vazodilatörlerle negatif ilişkisi yer alır.

Kadmiyum da onlarca yıldır preeklampsi için bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. Kurşunla olduğu gibi, Elongi Moyen ve ark. önemli ölçüde preeklamptik kadınlarda daha yüksek üriner kadmiyum düzeyleri gözlemlediklerini raporlamışlar ancak Maduray ve ark.’nın çalışmasında böyle bir bulgu saptanmamıştır.  “Obstetrik Riski Azaltmak İçin Maternal Oral Terapi” çalışması kapsamındaki bir vaka kontrol çalışmasında
ABD’nin güneydoğusundaki 172 kadından alınan sindirilmiş plasental numunelerde kadmiyum ölçülmüş ve artan preeklampsi odds’u ile ilişkili bulunmuştur. (düzeltilmişodds oranı [OR] = 1.5 [1.1- 2.2). Bu çalışma kesitsel olmakla birlikte, kadmiyum uzun yarı ömrü, plasenta dokusundaki seviyelerin gebelik boyunca kümülatif maruziyeti uygun şekilde temsil ettiğini düşündürür.⁷ 2014-2016 yılları arasında Çin’in Zhejiang Eyaletinde Wang ve arkadaşlarının yürüttükleri çalışmada alınan 132 vaka ve eşleşen kontrol grubu arasında hem anne kanındaki hem de plasenta dokusundaki kadmiyum seviyeleri sağlıklı hamile kadınlara kıyasla, preeklamptik kadınlarda yüksek bulunmuştur ancak yalnızca üçüncü trimester kan konsantrasyonu önemli ölçüde kovaryat ayarlamasından sonra preeklampsi ile ilişkili saptanmıştır (OR = 7.83 [1.64, 37.3]).⁸ İki çalışma arasındaki etki büyüklüğündeki fark, kadmiyumun ölçüldüğü farklı biyo-örnekler ve kadmiyuma maruz kalımın farklı arka plan oranları olmasından kaynaklanmaktadır.  Kadmiyumun plasental fonksiyon üzerindeki zararlı etkileri; reaktif oksijen türleri ve oksidatif stres kaynağı rolünden ileri geliyor olabilir. Aynı zamanda proinflamatuar sitokinlerin kaynağıdır ve plasental kan damarlarına zarar verebilir ve maternal kan basıncında artışa neden olabilir. Hayvan çalışmaları, kadmiyumun bağışıklık fonksiyonunu bozarak preeklampsiyi indüklediğini, plasentada ve böbreklerde artan oksidatif DNA hasarı yaptığını öne sürmektedir. In vitro çalışmalar, kadmiyumun dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGFβ) yolundaki genlerin ekspresyonunu epigenetik olarak artırdığını ve plasental trofoblast hücre göçünü inhibe ettğini göstermiştir.

Arsenik ve preeklampsi arasındaki ilişkiyi inceleyen çalışmaların sonuçları çeşitlidir. Elongi Moyene ve arkadaşları preeklamptik ve eklamptik hastalarda daha yüksek üriner arsenik atılımına yönelik bir eğilim saptamışlardır; ancak Maduray ve ark. böyle bir sonuç bildirmemişlerdir. Meksika Durango’da 104 preeklamptik kadın ve aynı hastaneden 202 sağlıklı kadının dahil edildiği bir vaka kontrol çalışmasında, Sandoval-Carrillo ve arkadaşları doğumdan önce spot idrarın yanı sıra doğumdan 1-3 hafta sonra katılımcıların evlerinin yakınındaki kuyulardan alınan içme suyu örneklerinde arsenik düzeylerini ölçmüşlerdir ve sonuçta arsenik düzeyleri ile pre-eklampsi oranları arasında bir fark bulamamışlardır.⁹ Ancak Durango yakınlarındaki içme sularının görece olarak daha az arsenik düzeylerine sahip olması gelecekte yapılacak çalışmaların daha yüksek arsenik konsantrasyonuna sahip iç alanlarda yapıldığında farklı sonuçlar verebileceğini düşündürmektedir.

Hem Elongi Moyene ve arkadaşları ve hem de Maduray ve arkadaşları preeklamptik kadınlarda normotansif kadınlara kıyasla daha yüksek krom seviyeleri gözlemlemişlerdir. Maduray ve arkadaşlarının çalışmasında ölçülen krom düzeyi pubik kıllarda olup maternal kanda değildi. Bu çalışmaların her ikisi de birden fazla ağır metalleri ölçmüşlerdir ve ikisinde de bu yüksek oranda ilişkili maruziyetlerin etkilerini hesaptan çıkarmak için ortak değişken ayarlamalı (covariate-adjusted) regresyon analizi gerçekleştirilmemiştir.

Son olarak, yakın zamanda yapılan tek bir analizde preeklampside cıva incelenmiştir. Mısır, Menoufia’da gerçekleşitirilen El-Badry ve arkadaşlarının yaptıkları prospektif bir kohort çalışmasında üç trimesterda da 124 gebe diş hekimi ve hastane yöneticisi personelde kreatinine göre düzeltilmiş idrar cıva konsantrasyonu ölçülmüş ve diş hekimi personelleri gebelik boyunca önemli ölçüde daha yüksek cıva konsantrasyonlarına sahip bulunmuş ve yöneticilere kıyasla preeklampsi oddsu 3.67 [%95 GA 1.25-10.8] bulunmuştur. Ayrıca iki ana antioksidanın; glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz konsantrasyonları da daha düşük bulunmuştur, cıvaya maruziyetin oksidatif stresi indükleyerek preeklampsi riskini artırabileceğini göstermektedir.¹⁰

Kalıcı Organik Kirleticiler (KOK)

KOK’lar, aşağıdakiler dâhil olmak üzere çeşitli içerik kategorilerini kapsar:

• Birçoğu dünyanın çeşitli yerlerinde yasaklanmış veya düzenlemye tabi tutulmuş olan diklorodifeniltrikloroetan (DDT) gibi organoklorlu (OC) pestisitler,
• Tekstilde, mobilya, elektronik ve yapı malzemelerinde alev geciktirici olarak kullanılan polibromlu difenil eterler (PBDE’ler),
• 1970’lerde üretimi yasaklanana kadar önceleri transformatörlerde ve kapasitörlerde soğutucu ve yalıtkan olarak, endüstriyel yağlayıcı ve boya ile esnek PVC’de plastizör olarak kullanılan poliklorlu bifeniller (PCB’ler),
• Halı ve kumaşlara leke ve suya dayanıklılık, yapışmaz yüzeyler oluşturmak için kullanılan ve yangın söndürme köpüğünde bulunan perfloroalkil maddeler (PFAS).

Bu kimyasallar doğada kalıcı olarak sebat ettiklerinden – ve PCB’ler ve PBDE’ler, yapılı çevreye dahil edilmiştir- üretimin kesilmesinden çok sonra da maruz kalım devam eder. Yüksek derecede lipofilik bu maddeler, yağ dokusunda biyolojik olarak birikirler ve besin zincirinde yukarı doğru hareket ederler. Nöro, immüno, repro ve genotoksik özellikleri ve çeşitli kanserlerle olan bağlantıları nedeniyle bu kimyasalların GHB da dahil olmak üzere kardiyovasküler etkileri de giderek daha fazla araştırılmaktadır.

İlk olarak 2004 yılında onaylanmış olan ve 2009’dan itibaren her iki yılda bir güncellenen Kalıcı Organik Kirleticiler hakkındaki “Stockholm Sözleşmesi” kapsamında, bugüne kadar organoklorlu pestisitlerin çoğunluğu da dahil olmak üzere 22 kimyasal eliminasyon için belirlenmiştir. Gelişmekte olan dünyanın bazı bölgelerinde sıtmayı kontrol etmek için kullanılan DDT’nin kısıtlı uygulamasına hâlâ izin verilmektedir.

Kırgızistan’da yakın zamanda yapılan bir kesitsel çalışmada Toichuev ve arktarihsel maruziyet açısıddan düşük, orta ve yüksek olan bölgelerde bulunan hastanelerdeki 508 plasenta örneğinde 11 tane OC pestisit (polihalojenlenmiş bileşik heksaklorosikloheksan (HCH), ve izomerleri a-HCH, P-HCH, y-HCH ve 8-HCH; p,p′-DDT vekontaminanları diklorodifenildikloroetilen (p,p’-DDE) ve diklorodifenildikloroetan (p,p’-DDD), aldrin; dieldrin; ve heptaklor) düzeylerini incelemişlerdir. Kadınlar da maruz kalmamış (tespit sınırının altındaki seviyeler) veya maruz kalmış olarak gruplanmıştır. Maruz kalan kadınlarda maruz kalmayan kadınlara kıyasla preeklampsi veya eklampsi riski on kat daha fazla (%7.5’e – %0.75) bulunmuş ancak bu çalışmada da araştırmacıların kadınların kişisel bilgilerine erişimi olmaması nedeniyle karıştırıcı faktörlerin rolü ve kontrolü sağlanamamıştır.¹¹  Güney Afrika, Limpopo Eyaletinde bir kırsal hastanede yapılan 733 kadının katıldığı bir kesitsel çalışmada Murray ve arkadaşları serum p,p′-DDT ve p,p′-DDE maruz kalımın daha yüksek olmasının,  kendi kendine bildirilen veya tanı konulmuş GHB için daha yüksek oranlarla ilişkilendirmişlerdir. Bu ilişki, her iki kimyasalla da ilişkili bulunmayan preeklampsiden ziyade, her ikisiyle de ilişkilii bulunan gestasyonel hipertansiyon üzerinden kurulmuş gözükmektedir. Bu gözlem, katılımcılar arasında preeklampsinin hipertansiyona kıyasla daha düşük oranda görülmesinin (%2) bir artefaktı olabilir. Bu çalışmada pop′-DDT ile bir ilişki bildirilmemiştir.¹²

Son olarak, Smarr ve ark.’nın Teksas ve Michigan’lı 258 kadında gebelik öncesi serumda 9 OC pestisite (HCB, β-HCH, γ-HCH, oksiklordan, transnonaklor, mirex, p,p′-DDT, o,p′-DDT ve p.p′-DDE) ait yaptıkları ölçümlerde bunların hiçbiri gestasyonel hipertansiyon ile ilişkilendirmemiştir, bu çalışmada da preeklampsiyi araştırmadıklarını belirtmek gerekir. ¹³ Analizlerinde, her sınıfta kalan kimyasalların toplamını dâhil ederek birden fazla kimyasala birlikte maruz kalımı bireysel maruz kalım modelleriyle kontrol etmeye çalışmışlardır. Murray ve arkadaşlarının çalışmasının sonuçları ile bu çalışmanın sonuçları arasındaki farklar için örneklem büyüklüğü bir faktör olabilir, ancak aynı zamanda Güney Afrika kohortunda daha yüksek pestisit maruziyet seviyelerini yansıtıyor olması söz konusudur.

Smarr ve arkadaşları 10 PBDE türdeşini incelemiş (17, 28, 47, 66, 85, 99, 100, 153, 154, 183), ancak gebelik hipertansiyonu ile ilişki bulunamamıştır. Tahran’da üç üniversite hastanesinde yapılan, Eslami ve arkadaşlarının çalışmasında 45 preeklamptik ve 75 normotansif kadın arasında toplam PBDE konsantrasyonu (28, 47, 99, 100, 153, 154, 183, 209 türdeşlerinin toplamı) preeklampsi için düzeltilmiş oddsu artırdığı bulunmuş (OR = 2.19 [1.39-3.45]), ancak birlikte maruziyeti hesaba katmak için toplam PCB konsantrasyonu modele eklendiğinde ilişki zayıflamış bulunmuştur (OR = 1.53 [0.90- 2.58]). Bu ilişki iki değişkenli analizde preeklamptik kadınlarda önemli ölçüde daha yüksek saptanmış olan 28, 47, 99 ve 153 PBDE’ler tarafından yönlendirilmiş gibi görünmüştür.¹⁴ Toplam PCB konsantrasyonu (28, 52, 99, 101, 118, 138, 153, 180 ve 187 türdeşlerinin toplamı) ayrıca hem total hem de total PBDE olmadan ayarlanmış modellerde preeklampsi odds’unu  önemli ölçüde artırdığı saptanmıştır. (OR = 1.77 [1.34-2.32] her ikisi için). Bu ilişki de 28, 118, 138, 153, 180 ve 187 PCB’leri tarafından yönlendirilmiş gibi görünmektedir.

Norveç Anne ve Çocuk Kohort Çalışmasında 976 nullipar katılımcıdan oluşan alt kümeye sahip yakın zamanlı bir çalışmada ikinci trimesterde plazma örneklerinde ölçülen 7 PFAS ile preeklampsi arasındaki ilişki incelenmiş ancak artmış risk bulunamamş ve hatta perfloroundekanoik asitin (PFUnDA) koruyucu olabileceği bulunmuştur.  Doz- yanıt fonksiyonunın şekli kısıtlı kübik eğriler kullanılarak çizildiğinde, PFAS ve preeklampsi arasındaki ilişki doğrusal olmayabilir ve etkilerinin bu çalışmada mevcut olandan daha yüksek maruziyet seviyelerinde saptanabilir olması daha olasıdır.¹⁵

Floropolimerlerin üretiminde PFAS kullanan bir kimyasal tesisin çevresinde yaşayan bir Appalachian topluluğundaki sağlık sonuçlarını araştırmak üzere C8 Sağlık Projesi kapsamında yürütülen daha önceki çalışmalarda, serum perflorooktanoik asit (PFOA) ve perflorooktan sülfonat (PFOS) düzeyleri ile preeklampsi arasında zayıf ilişki (OR = 1.3, [0.9- 1.9] ve 1.3 [1.1-1.7], sırasıyla) bulunmuştur. Bu bulgular PFAS’ın azalmış çift ​​doğurganlığı ve düşük doğum ağırlığı ile ilişkilerini bildiren diğer çalışmalarla uyumludur. Bunda varsayımsal mekanizmalar; endokrin bozulmaları içerir ancak laboratuvar verileri, Batı popülasyonları için maruziyet ilişkili konsantrasyonlarda PFAS’ın östrojen veya androjen reseptör aktivitesi, steroidogenez veya üreme hormonlarının seviyelerini etkilemediğini öne sürmektedir.

Kalıcı olmayan Kimyasallar

Yarı ömürleri yıllarla ölçülen KOK’lar, kurşun ve kadmiyumdan farklı olarak kalıcı olmayan kimyasalların çoğu saatler içinde metabolize olur. Kümülatif maruz kalım bir sorun olmasa da, bu kimyasalların her yerde bulunmasından dolayı, bireyler kronik olarak maruz kalabilirler ve bu da yaşam boyunca sağlık üzerindeki etkileri ile sonuçlanabilir.

Sert, şeffaf plastiklerin üretiminde kullanılan BPA, birçok tüketici ürününden aşamalı olarak kaldırılmaktadır. Bununla birlikte, su borularını ve metal gıda kutularını hizalamak için epoksi reçinelerinde hala kullanılan bir bileşendir ve baskılı termal makbuz/fiş kâğıdı ve diş macunlarında bir bileşendir. En çok bir endokrin bozucu olarak bilinen BPA, yetişkinlerde üreme üzerinde olumsuz sonuçlar ve doğum öncesi maruz kalım çocuklarda nörodavranışsal, gelişimsel, metabolik ve solunumsal olumsuz etkilerle ilişkilendirilmiştir. BPA’nın ayrıca Yetişkinlerde KVH, obezite ve tip 2 diyabet riskini artırdığı gösterilmiştir ki bu da GHB’yi uyarma potansiyeline işaret etmektedir. Yakın zamanda iç içe geçmiş iki vaka kontrol çalışması BPA ve preeklampsi arasındaki ilişkiyi incelemiştir. Cantonwine ve arkadaşlarının çalışması bir gebelik kohortunda doğum öncesindeki üç ziyarette alınan idrar örneklerinde BPA ölçümünü gerçekleştirmiştir. 50 preeklamptik kadın ve 432 normotansif kadının dâhil edildiği çalışmada ilk trimester BPA konsantrasyonundaki çeyrekler arasındaki artış genel olarak artan preeklampsi riski ile ilişkiliydi (Riziko Oran = 1.53 [1.04- 2.25]), ancak bebek cinsiyetine göre sınıflandırıldığında, yalnızca kız bebekler arasındaki sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kaldı (Riziko Oranı = 1.58 [1.20-2.08]).¹⁶ Diğerlerinin aksine, Cantonwine ve arkadaşları  kronik hipertansiyonu bulunan kadınları dışlamamıştır. Ye ve arkadaşları Çin’de 99 normotansif kadın ve 74 preeklamptik hastadan ikinci trimesterda elde edilen serum örneklerinde analiz edilen BPA konsantrasyonunda BPA konsantrasyonu genel olarak artmış preeklampsi odds oranları (OR = 1.39 [1.19- 1.63]) ile ilişkiliydi ve  hafif, şiddetli, erken başlangıçlı veya geç başlangıçlı grup ile sağlıklı kontroller kıyaslandığında ​​da benzer sonuçlar görülmüştü. Ye ve arkadaşlarının bulguları kontaminasyon potansiyeli ve kalıcı olmayan kimyasalların konsantrasyonlarının daha düşük konsantrasyonlarda olması ile tespit edilememe riskinin daha yüksek olması nedeniyle idrar ölçümü ile kıyasla daha az güvenilir olan serumdaki BPA ölçümüne dayalı olsa da Cantonwine ve arkadaşlarının çalışmasındaki bulgular ile tutarlıydı. ¹⁷

Son zamanlarda yapılan bir dizi çalışma, BPA’nın plasental fonksiyonu etkileyebileceği ve GHB’ye yol açabileceği bazı biyolojik mekanizmaları incelemiştir. BPA ile plasenta dokusunda global metilasyon artışı arasındaki ilişki,  üçüncü trimesterda plasental dokusundaki fetüsü yabancı kimyasallardan koruyan ABCG2 taşıyıcısının down-regülasyonu, moleküller endotelin reseptörü tip b’yi hedefleyen ve  bunun da sonuçta pulmoner arteriyel hipertansiyon riskinin artmasıyla bağlantılı olan miR-146a seviyelerindeki artış ile ilişkisi, trofoblast göçü ve invazyonunun inhibisyonu ve trofoblast apoptozunun indüklenmesi gibi birkaç potansiyel ipucu tanımlanmıştır.

Cantonwine ve arkadaşları ile aynı kohort üzerinde çalışan Ferguson ve arkadaşları BPA’nın plasental vaskülarizasyonu etkileyen faktörler, özellikle maternal serumunda ölçülebilir ve preeklampsi için prediktör olduğu bilinen çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFlt-1, antianjiyogenik) ve plasental büyüme faktörü (PlGF, anjiyojenik) ile ilişkisini incelemişlerdir. İdrar BPA konsantrasyonu gebelikte farklı zamanlarda eş zamanlı olarak ölçülen hem sFlt-1 hem de sFlt-1’in PlGF’ye oranındaki artışlarla ilişkili bulunmuştur.¹⁸ Rotterdam’da gerçekleştirilen popülasyon temelli prospektif bir kohort çalışması olan R Kuşağı kohortunda aynı sonuca ilişkin yazarların kendi çalışmasında da, ilk trimesterdaki BPA, BPS (giderek yaygınlaşan ikame kimyasalı) veya toplam BPA, BPS ve BPF’nin plasental anjiyojenik belirteçler veya ağırlık, doğum öncesi kan basıncı veya GHB riski ile ilişkili bulunmamıştır.¹⁹ Bununla birlikte, daha yüksek toplam bisfenol düzeyinin, ikinci trimester göbek umblikal arteri pulsatilite indeksinde daha yüksek değerlerle ilgili (Bonferroni düzeltmesinden sonra azaltılan etki) olduğunu ve bunun GHB ile ilişkili olan yüksek plasental vasküler direnç için bir indikatör olduğunu bulmuşlardır.

Dr. Begüm Öktem’in Bisfenol A’nın Nörotoksik ve Üreme ilişkili etkilerini ele aldığı bölüm 1  ve bölüm 2 yazılarına buradan ulaşabilirsiniz.

Fitalatlar, her yerde bulunan kalıcı olmayan başka bir sınıf kimyasallardır. Fitalatlar plastikte esnekliği arttırmak için kullanılır ve yaygın olarak vinil döşemeler, tıbbi borular, hap kaplamaları, yağmurluklar, otomobiller, yiyecekleri ve oje, sabun ve şampuan gibi kişisel bakım ürünlerini sarmak için kullanılan plastik filmlerde kullanılırlar.

Fitalat metabolitleri ve GHB arasındaki ilişkiyi değerlendiren yakın zamanlı iki çalışma söz konusu olup Cantonwide ve arkadaşlarının doğum öncesi idrarda dokuz fitalat metabolitinden monoetil ftalatta (MEP) ölçülür ve dört di (2-etilheksil) fitalat (DEHP) metabolitinin toplamı preeklampsi riski ile pozitif ilişkili bulunmuştur ve ilişkinin sadece bebekleri cinsiyete göre sınıflandırıldıklarında kadın cinsiyette istatistiksel olarak anlamlı olduğunu raporlamışlardır.¹⁶  Cincinnati’de prospektif bir gebelik çalışmasında da Werner ve arkadaşları 369 kadında gebelik sırasında iki kez ölçülen fitalat konsantrasyonlarının, doğum öncesi, gestasyonel hipertansiyon, preeklampsi, eklampsi, HELLP sendromu ve kombine bir GHB sonucu değişken olmak üzere çoklu ölçülen maternal kan basıncı ile arasındaki ilişki incelenmiştir.  İdrar mono-benzil fitalatın (MBzP) gebeliğin erken ve orta dönemindeki artan diyastolik kan basıncı ve artmış HDP riski ile ilişkili olduğunu saptamışlardır ve MBzP’nin spiral arter invazyon ile etkileşiyor olabileceği, dolayısıyla anormal plasenta gelişim riskini artırıyor olabileceği  teorisini öne sürmüşlerdir.²⁰ Benzer bir bulgu, Gao ve arkadaşlarının mono-2-etilheksil ftalat (MEHP) ile azalmış trofoblast invazyonu, pozitif trofoblast düzenleyici olan MMP-9’un azalmış ekspresyonu ve negatif trofoblast düzenleyici TIMP-1’in artan ekspresyonu arasında bir ilişki olduğunu gösteren çalışmasında yer almıştır.²¹ Ferguson ve arkadaşları da, idrar DEHP metabolitlerinin toplam konsantrasyonunun azalmış PlGF ve artan sFlt-1/PlGF oranı ile ilişkili olduğunu ve fitalatların plasental vasküler sistemi değiştirebileceği fikrini öne sürmüşlerdir.¹⁸

R jenerasyonu çalışmasında ilk tirmesterda idrar yüksek moleküler ağırlıklı ftalatlar  ile her ikisi de artmış DEHP metaboliti tarafından yönlendirilen sFlt-1 ve sFlt-1/PlGF oranı mono-(2-karboksimetil)heksil ftalat (mCMHP), arasındaki ilişkilerde antianjiyogenik etkiler benzer bulunmuştur. Ayrıca çeşitli ftalatlar ile umbilikal arter pulsatilite indeksi, uterin arter direnci, çentiklenme (notching) ve plasenta ağırlığı arasında düşündürücü ilişki saptanmış ancak hiçbiri çoklu düzeltmeden sonra istatistiksel olarak anlamlı bulunamamştır. BPA’da olduğu gibi, fitalat maruziyeti için cinsiyet açısıdan dimorfik etkiler bulunmuştur: bir çalışmada, plasentalar sadece erkek bebeklerde daha kalın ve daha yuvarlak olup, diğer bir çalışmada plasenta literatüründen seçilen aday mRNA’lar üzerindeki çeşitli fitalat metabolitlerinin ilişkisi cinsiyete göre farklılık göstermiştir.

Çoğu OC pestisitinin ortadan kalkmasından bu yana, kalıcı olmayan OP pestisitler norm haline gelmiştir. Özellikle tarım toplulukları maruz kalırlar, ancak kentsel alanlarda da meyve ve sebze tüketimi yoluyla OP pestisitlerine maruz kalan popülasyonlarda seviyeler tespit edilebilir. OP pestisit kullanımı ve GDB ile ilgili epidemiyolojik literatür yetersizdir, ancak Shaw ve arkadaşları tarafından yeni yayınlanan bir çalışmada California’nın San Joaquin Vadisinde geniş tarım bölgesine ait bir hastaneden 1998’den 2011’e ait taburcu verileri (> 200.000 doğum) incelenmiş olup  bireysel veya fizikokimyasal gruplamalarda,  konsepsiyonun 1 ay öncesi ile doğuma kadar 543 pestisitten herhangi birine maruz kalımın artmış preeklampsi riski ile ilişkili bulunmamıştır, öyle ki bazı kimyasallarla hafifçe koruyucu gibi görünmektedir. Ancak bu çalışmada maruz kalımlar, sonuçlar ve ortak değişkenler hakkında veri çıkarırken doğumda belirtilen ikamet adresi ve adreste geçirilen süreye ilişkin değerlendirme yapamama, yanlış sınıflama yapma gibi riskler dolayısıyla kısıtlılıklara sahiptir. Ayrıca yazarlar da bulguların erken dönemdeki gebelik kayıplarından etkilenebileceği prematür fetal kayıp ve pestisidler arasındaki ilişkinin de doğum kayıtlarını kullanarak tespit edilmesinin mümkün olmadığını belirtmişleridir.²²

Prenatal maruz kalım ile çocuklarda nörogelişimsel etkiler arasında ortaya konmuş bağlantılar nedeniyle Avrupa, ABD ve diğer bazı bölgelerde kullanımı kısıtlanmış ancak dünyanın çoğu yerinde tarımsal bir madde olarak kullanılmaya devam edilen bir OP pestisiti olan klorpirifos (CPF) hakkında birçok mekanizmaya yönelik araştırma yürütülmüştür. Tek bir merkezde yürütülen bir dizi in vitro çalışmada sonucunda, CPF şunlarla ilişkilendirilmiştir:

• ABCG2’nin artan ekspresyonu,
• PlGF ve diğer plasentaya özgü genlerin ekspresyonunun kontrolünde yer alan bir transkripsiyon faktörü olan GCM1’in ekspresyonu
• Plesenta trofoblast hücrelerince üretilen ve insan koryonik beta alt birimi gonadotropin (βhCG) ekspresyonu.²³

CPF’ye maruz kalan JEG-3 hücreleri de artmış oksidatif ve endoplazmik retikulum stres kanıtı göstermiştir. CPF’ye maruz kalan plesental dokuda artmış stroma hücre apopitozu ve değişmiş villus matris bileşimi, bazal membran kalınlığı ve plasental eksplantta trofoblastik tabaka bütünlüğü gözlenmiştir.  Diğer iki laboratuvarda ise klorpirifosin, plesenta hücrelerinde artan TNF-a apopitozu ile ilişkilendirilebileceği ve inflamatuar sitokinlerin CPF’ye maruz kalan hücrelerde diferansiyel modülasyonunun ve diğeri ise CPF’nin indüklediği toksisitenin mitokondriyal potansiyel kaybı ve nükleer parçalanma ve yoğunlaşma görünümü ile  karakterize edildiği gibi bir grup düşündürücü mekanizma bulunmuştur.

Sonuçlar

Çevresel toksik maddelere maruz kalım ve GHB ile ilgili literatüre son eklenenler ile bildiklerimizin kapsamı büyük ölçüde genişlemiştir. Uluslararası Jinekoloji ve Obstetrik Federasyonu, Amerikan Üreme Tıbbı Derneği, Amerikan Pediatri Akademisi ve Endokrin Derneği klinsiyenlere, gebe hastalarına çevresel toksik maddelere maruz kalımı sınırlamaları için hamile hastalarına tavsiyelerde bulunmaları yönünde öneride bulunmaktadır.

Her ne kadar etkiler bazen düşük maruz kalım tespit edilemese de bu konudaki kanıtlardan en güçlüleri kurşun, kadmiyum, OC pestisitler ve PCB’ler dahil olmak üzere kalıcı kimyasallar ile preeklampsi arasındaki ilişki ile ilgilidir.  Araştırılan diğer ağır metaller arasında, arsenik preeklampsi ile ilişkili görünmemektedir ancak ortaya çıkan kanıtlar, cıva ve kromun endişe verici olabileceği yönündedir.  PBDE’ler ve PFAS preeklampsi ile güçlü bir şekilde ilişkili değildir ancak bu maruziyetlerle ilgili literatür oldukça sınırlıdır ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Kalıcı olmayan kimyasallar arasında BPA ve plasental fonksiyon ve gelişme arasındaki ilgi çekici ilişkiler bazen HDP sonuçları için bulgular tutarsızlığı artırır görünmektedir. Bazı çalışmalar fitalatlar ile hem plasental hem de GHB arasında ilişki öne süren sonuçlara sahip olsa da hangi fitalat metabolitinin sorumlu olduğu konusunda çelişkiler söz konusudur. OP pestisitlerle ilgili sonuç çıkarmak için de daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Burada yer verilen güncel çalışmalar çevresel toksik madeeler ile GHB arasındaki ilişkinin temelinde yatan oksidatif stres, epigenetik değişiklikler, endokrin bozulma ve anormal plasental vaskülarizasyon gibi biyolojik mekanizmaların bazılarına ışık tutmaktadır.

Bu sonuçlar, GHB yolunda yer aldığı için gebelik boyunca fizyolojik ölçümler ve biyoörneklerin toplandığı ve daha çok prospektif epidemiyolojik çalışma yürütülmelidir; böylece laboratuvar çalışmalarının sonuçları in vivo olarak da doğrulanabilir.

Prospektif çalışmalar ile çevresel kimyasal maddelere maruz kalıma ilişkin bu maddelerin özellikle zararlı etkileri, potansiyel olarak düşüğe neden olmaları gibi ara dönem sonuçları göstererek gebelikte kritik dönemlerin olup olmadığı keşfedilebilir.

Kesitsel çalışmalarda, ters nedensellik potansiyeli söz konusu olabilir; örneğin GHB’nin biyokimyasal profili depolandığı dokulardan çevresel kimyasalların daha fazla mobilize olmasına yol açıyor olabilir. Bu nedenle prospektif çalışmalar maruz kalımın zamanla ilişkisini koymada da araştırmacılara daha fazla katkı sağlayabilir.

Bu makalede yer verilen sonuçların bazıları bebek cinsiyetine spesifikti, bu sonuç endokrin-bozucu kimyasallara ait çalışmaların ve plasenta ilişkili sonuçların; plasentanın parsiyel olarak fetal dokudan oluşması ve potansiyel olarak cinsiyet ile etkileşimde olması nedeniyle pekişmektedir.

Çevresel toksik maddeler bir arada bulunabildiğinden, sadece bir kimyasala ait değil aynı zamanda aralarındaki etkileşimleri uygun şekilde modelleyen istatistiksel yöntemler kullanılarak kimyasal karışımlara maruz kalım da değerlendirilmelidir. Analizler ayrıca doğrusal olmayan etkilerin modellerini de içermelidir.

Son olarak, bir yaşam seyri bağlamındaki ilişkiyi inceleyen daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Gebelik bir boşlukta oluşmaz ve bir kadının gebelik öncesindeki kimyasal maruz kalımları ve kardiyovasküler risk faktörleri olup olmaması gebeliğin “stres testini” geçmesi ve takip eden yıllarda KVH geliştirip geliştirmemesinde rol oynayabilir.

Kadınların gebelik öncesi dönemden doğum sonrası dönem ve ötesine kadar takip eden çalışmalar, gebelik öncesinde de var olabilen ve sadece GHD değil sonraki aşamada KVH’ı da önlemede yardımcı olabilecek müdahelelere imkân tanıyan GHB risk faktörlerinin belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

ANAHTAR NOKTALAR

• Her ne kadar düşük maruz kalım düzeylerinde bazen ilişki ortaya konulamıyor olsa da kurşun, kadmiyum, organoklorin pestisitler ve polisiklik bifeniller gibi kalıcı kimyasallarla preeklampsi arasındaki ilişkiye ait kanıtların düzeyi en güçlüdür.

• Biyolojik yolaklar; oksidatif stres, epigenetik değişiklikler, endokrin bozulma ve anormal pleasental vaskülarizasyonu içerebilir.

• Çevresel maruziyetlerin yaşam süresince yolunu ve kadın üreme ve kardiyovasküler sağlığını değerlendirmek için prekonsepsiyon periyodunun başlangıcından itibaren ve postpartum sürecini de kapsayan ek prospektif epidemiyolojik çalışmalar gereklidir. Gelecekteki çalışmalar ayrıca kimyasalların birbirleriyle interaksiyonunu ve doğrusal olmayan ilişkileri üzerine de odaklanmalıdır.

KAYNAKLAR

1. Kahn LG, Trasande L. Environmental toxicant exposure and hypertensive disorders of pregnancy: recent findings. Curr Hypertens Rep. 2018;20(10):1-10.
2. Brown MC, Best KE, Pearce MS, Waugh J, Robson SC, Bell R. Cardiovascular disease risk in women with pre-eclampsia: systematic review and meta-analysis. Eur J Epidemiol. 2013;28(1):1-19.
3. Wu P, Haththotuwa R, Kwok CS, et al. Preeclampsia and future cardiovascular health: a systematic review and meta-analysis. Circ Cardiovasc Qual Outcomes. 2017;10(2):e003497.
4. Stuart JJ, Tanz LJ, Missmer SA, et al. Hypertensive disorders of pregnancy and maternal cardiovascular disease risk factor development: an observational cohort study. Ann Intern Med. 2018;169(4):224-232.
5. Bayat F, Akbari SAA, Dabirioskoei A, Nasiri M, Mellati A. The relationship between blood lead level and preeclampsia. Electronic physician. 2016;8(12):3450.
6. Elongi Moyene J-P, Scheers H, Tandu-Umba B, et al. Preeclampsia and toxic metals: a case-control study in Kinshasa, DR Congo. Environmental Health. 2016;15(1):1-12.
7. Laine JE, Ray P, Bodnar W, et al. Placental cadmium levels are associated with increased preeclampsia risk. PLoS One. 2015;10(9):e0139341.
8. Wang F, Fan F, Wang L, Ye W, Zhang Q, Xie S. Maternal cadmium levels during pregnancy and the relationship with preeclampsia and fetal biometric parameters. Biol Trace Elem Res. 2018;186(2):322-329.
9. Sandoval-Carrillo A, Méndez-Hernández EM, Antuna-Salcido EI, et al. Arsenic exposure and risk of preeclampsia in a Mexican mestizo population. BMC Pregnancy Childbirth. 2016;16(1):1-5.
10. El-Badry A, Rezk M, El-Sayed H. Mercury-induced oxidative stress may adversely affect pregnancy outcome among dental staff: a cohort study. The International Journal of Occupational and Environmental Medicine. 2018;9(3):113.
11. Toichuev RM, Zhilova LV, Paizildaev TR, et al. Organochlorine pesticides in placenta in Kyrgyzstan and the effect on pregnancy, childbirth, and newborn health. Environmental Science and Pollution Research. 2018;25(32):31885-31894.
12. Murray J, Eskenazi B, Bornman R, et al. Exposure to DDT and hypertensive disorders of pregnancy among South African women from an indoor residual spraying region: The VHEMBE study. Environ Res. 2018;162:49-54.
13. Smarr MM, Grantz KL, Zhang C, et al. Persistent organic pollutants and pregnancy complications. Sci Total Environ. 2016;551:285-291.
14. Eslami B, Malekafzali H, Rastkari N, Rashidi BH, Djazayeri A, Naddafi K. Association of serum concentrations of persistent organic pollutants (POPs) and risk of pre-eclampsia: a case–control study. Journal of Environmental Health Science and Engineering. 2016;14(1):1-8.
15. Starling AP, Engel SM, Richardson DB, et al. Perfluoroalkyl substances during pregnancy and validated preeclampsia among nulliparous women in the Norwegian Mother and Child Cohort Study. Am J Epidemiol. 2014;179(7):824-833.
16. Cantonwine DE, Meeker JD, Ferguson KK, Mukherjee B, Hauser R, McElrath TF. Urinary concentrations of bisphenol A and phthalate metabolites measured during pregnancy and risk of preeclampsia. Environ Health Perspect. 2016;124(10):1651-1655.
17. Ye Y, Zhou Q, Feng L, Wu J, Xiong Y, Li X. Maternal serum bisphenol A levels and risk of pre-eclampsia: a nested case–control study. The European Journal of Public Health. 2017;27(6):1102-1107.
18. Ferguson KK, McElrath TF, Cantonwine DE, Mukherjee B, Meeker JD. Phthalate metabolites and bisphenol-A in association with circulating angiogenic biomarkers across pregnancy. Placenta. 2015;36(6):699-703.
19. Gaillard R, Arends LR, Steegers EA, Hofman A, Jaddoe VW. Second-and third-trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications: the Generation R Study. Am J Epidemiol. 2013;177(8):743-754.
20. Werner EF, Braun JM, Yolton K, Khoury JC, Lanphear BP. The association between maternal urinary phthalate concentrations and blood pressure in pregnancy: The HOME Study. Environmental Health. 2015;14(1):1-9.
21. Gao F, Hu W, Li Y, Shen H, Hu J. Mono-2-ethylhexyl phthalate inhibits human extravillous trophoblast invasion via the PPARγ pathway. Toxicol Appl Pharmacol. 2017;327:23-29.
22. Shaw GM, Yang W, Roberts EM, et al. Residential agricultural pesticide exposures and risks of preeclampsia. Environ Res. 2018;164:546-555.
23. Ridano ME, Racca AC, Flores-Martín J, et al. Chlorpyrifos modifies the expression of genes involved in human placental function. Reprod Toxicol. 2012;33(3):331-338.